非洲猪瘟防控专题---第一届兽医检测诊断大会
非洲猪瘟防控专题---第一届兽医检测诊断大会
一、 非洲猪瘟流行病学概述（澳大利亚动物健康实验室大卫•威廉姆斯）
大卫•威廉姆斯在大会上作报告
1、非洲猪瘟病毒的毒力类型和发病特点
非洲猪瘟病毒（ASFV）分为强毒力、中等毒力和低毒力三种类型（Pan and Hess, 1984）。
强毒力毒株临床引起特急性（感染后1-4天死亡）和急性（感染后3-8天死亡）临床案例。中等毒株毒株引起急性（感染后11-15天死亡）和亚急性（感染20天以后死亡）临床案例。临床条件下，急性ASF的发病周期为7天而亚急性的发病周期为10-20天。中等毒力和低毒力毒株可能引起慢性ASF（Mebus and Dardiri, 1979; McVicar, 1984），目前慢性ASF只在西班牙、葡萄牙和多米尼加共和国报道。
不同类型ASF的死亡率如下图1所示：
图1. 不同类型ASF导致的猪只的死亡率（来源于FAO）
2、非洲猪瘟病毒的抵抗力：
3、ASF临床症状
非洲猪瘟病毒（ASFV）分为强毒力、中等毒力和低毒力等三种类型。强毒株可引起最急性型（感染后1-4天死亡）和急性型（感染后3-8天死亡）临床经过。中等毒力毒株可引起亚急性型，感染20天后死亡，但死亡率低。强毒力和中等毒力毒株引起的症状是以发热和网状内皮组织出血为特征。低毒力毒株可引起慢性型。高毒力和中等毒力毒株均可引起妊娠母猪发生流产。
最急性型和急性型 发病猪体温达41-42℃，食欲废绝、精神沉郁、呼吸困难，皮肤充血变红或变蓝色；可发生呕吐、腹泻、甚至血便，偶见便秘。出现症状后1-4天内死亡，也可在未出现症状就死亡。发病仔猪的耳、鼻、唇和腿皮肤发红，可见神经症状，数小时内死亡。发病率和死亡率可达100%。
亚急性型 病猪出现中度发热，食欲下降。亚急性ASF中，主要是出血和水肿，比急性型更为强烈。感染猪在感染后7-20天死亡，死亡率为30%-70%。耐过猪约3-4周后康复，但成为带毒猪。
慢性型 特征是不出现出血性变化，但皮肤发生坏死、局部红斑或凸起，常见于耳部、腹部和大腿内侧等部位。感染猪也可出现呼吸道症状。感染猪可出现血清学阳性。由于病毒的持续感染，康复猪成为病毒携带者。
4、ASF的流行病学周期：
5、ASF的传播
6、ASF病毒传染性不强：
总结，ASF病毒的物理特性耐受性强，加上低“传染性”和高死亡率，使其能够有效传播和持续存在；ASF通过受感染的猪和肉类/产品跨界、跨大陆传播潜力；受影响大陆内和大陆间的不同流行病学特征和传播周期；了解流行病学有助于制定有针对性的监测和控制策略。
二、非洲猪瘟诊断病原学技术（澳大利亚动物健康实验室大卫•威廉姆斯）
1、非洲猪瘟的实验室诊断程序
2、ASFV感染后动力学
病毒血症和散毒
血液中病毒含量高，
鼻和粪便拭子病毒水平低于2-3logs
病毒散毒发生于临床症状出现前两天
口腔液作为早期诊断推荐样品，EDTA抗凝全血推荐为确诊样品，谨慎剖检
在高毒力非洲猪瘟病毒GRG/07中：在血液、脾和淋巴结中病毒滴度高
3、报道的非洲猪瘟的主要PCR检测方法：
4、学到什么
多种病毒学和分子方法可用于检测和鉴定ASF病毒
• PCR是疫情调查和常规诊断的前沿检测方法
• 敏感,特定，快速
• 抗原检测试验敏感性较差，但成本低，速度快
• 病毒分离依赖于原代猪细胞，需要新的敏感细胞系
三、非洲猪瘟诊断血清学技术（澳大利亚动物健康实验室大卫•威廉姆斯）
1、 ASFV感染后动力学
病毒和抗体检测都应在爆发和控制/根除中进行
对于急性疾病的爆发，病毒检测（PCR）最有用，血清学诊断价值较低，因为大多数猪在抗体反应前死亡，在7-10天内；但是如果存在幸存的猪只，特别是ASFV转变为中等毒力或者弱毒力毒株之后，抗体检测的作用凸显；
2、抗体检测------ 一般考虑因素
• 由于没有疫苗，抗体的存在表明当前或过去的感染
• 抗体出现较早(7-10 dpi)，可在幸存者中持续数年
• 然而，在急性期或急性感染中，猪只常在产生可检测到的抗体之前死亡。因此，在疫情调查中也应采集样本进行病毒检测
• 抗体不能完全中和
• 建议进行以下血清学检查:
– ELISA作为一种筛选工具
– 间接荧光/过氧化物酶抗体试验(IFA/IPX)或免疫印迹(IB)确认
3、抗体检测的样品类型
• 血清
• Haemolysis à false positives in ELISA
• 溶血 à ELISA假阳性
• 血浆
• 猪肉浸出液，组织渗出物
• 口腔液
• 取样方便，无创
• Ab水平低于全血或血清
• 干血(滤纸或拭子)：方便取样和储存(例如在偏远地区或没有冷链时)；Ab水平低于全血或血清
4、 抗体检测-取样技术
建议在处理和检测前加热灭活血清中的ASF病毒，以达到生物抑制和方便；
OIE推荐:56℃/70分钟或60℃/20分钟然而，这些条件可能无效
5、ELISA的优缺点：
• 优点
• 快速测试与解释
• 高通量、自动化
• 缺点
• 在监测研究中，IPX/IFA的敏感性低于IPX/IFA，可能代表的血清价偏低；当使用质量差的样品时，其特异性容易降低；确认性测试很重要，如果可能的话
6、口腔液的诊断潜能：
• 唾液和血清中含有抗体和病原体的混合物
• 作为猪病原体的另一种诊断样本
• 比如PRRSV, PCV2, influenza, ASFV
• 在圈中采样时，代表群(组)样本
• 成本效益高、简单、安全、“福利友好”、劳动强度较低
• 有潜力对大量猪群进行有效监测
总结：
• 一系列血清学技术可用来可靠地检测抗体的ASFV
• 建议与病毒检测方法一起使用，但在急性ASF暴发中，血清学的诊断价值较低
• 最常用的ELISAs; Se的不同水平
• IFA/IPX测定的Se最高，但主要用于参考实验室的确认
• 其他样本类型可用于抗体检测(例如血样、口腔液、组织渗出液)
四、精准检测，精确防控
世纪元亨董事长陈西钊博士在大会上作报告
1、如何做到“精准检测”
v样品“精准”
§ 按“节点”连续采样原则
§ “母猪分胎次、仔猪分周龄”
§ 科学的检测周期
检测目标“精准”： 需要检测病原还是抗体？免疫抗体与野毒感染抗体？
选择适宜检测试剂：选择适合自己的试剂；动物疫病检测是群体检测，而非“个体诊断”，敏感性与特异性要平衡
系统思维，综合判断
• 检测数据的动态变化趋势；抗原与抗体检测数据的有机结合
确保结果准确：建立实验室质量控制体系
2、举例
五、探讨ASF PCR结果准确性的影响要素
爱德士徐灵龙总监在大会上作报告
ASF PCR结果准确性的影响要素：
• DNA提取试剂盒提取效率
• ASF PCR试剂盒性能
• 荧光定量PCR仪器效果
• 操作过程的标准化程度
1、DNA提取试剂盒提取效率
DNA提取目的：除去PCR抑制剂；增加靶核酸浓度；增加样本的均一性
DNA试剂盒的提取效率是大家往往忽略的一个环节，但这确是影响PCR检测结果重要因素。主要可以从DNA提取产率、提取纯度、提取完整性等方面进行综合评估。
样本中的PCR抑制剂：
来源：内源性如免疫球蛋白、蛋白酶、血红素极其代谢物、白细胞内的乳贴蛋白、脂类、多糖等；外源性如肝素抗凝剂、纤维素、手套滑石粉、EP管等器材上的抑制物
机制：干扰细胞裂解；降解或包裹核酸；热稳定DNA聚合酶失活
2、ASF PCR试剂盒性能
• ASF PCR试剂性能评价
- 分析敏感性（兼容性、最低检出限）
- RT-PCR扩增效率
- 分析特异性（排他性）
- 诊断敏感性和诊断特异性
- 混样检测
- 重复性
- 稳定性
- 容忍度测试
- 其他（假阴性监控、环境污染监测、操作简便性）
3、荧光定量PCR仪器效果
• 控温模块的精度及均一性
• 信号检测的灵敏度
• 激发光源及荧光检测
• 通道数量及支持染料
4、操作过程的标准化程度
• PCR实验室污染控制程度
- PCR实验室的分区
各区独立、注意风向、因地制宜及方便工作
• 移液技术
- 移液器及枪头的选择
- 标准移液技术
- 特殊样品处理
- 移液器维护保养及校准
• 取样、样本质量及样本前处理
- RealPCR* ASFV样品类型
• 血清/血浆/EDTA抗凝血
• 口腔黏液
• 组织（肺、骨髓、扁桃体、肾、淋巴结等）
• 冻肉
• 饲料
• 环境拭子（养殖场、运输车辆等）
• 鼻拭子
• 精液
• PCR实验室清洁、废弃物处理及环境污染监测
六、面对非洲猪瘟猪场监测的重点
爱德士猪产品线现场技术服务总监李昭春先生在大会上作报告
爱德士猪产品线现场技术服务总监李昭春先生就面对非洲猪瘟猪场检测的重点与参会嘉宾进行了探讨。
1、猪场风险评估体系的建立
猪场应该根据自身猪场特点，对整体区域进行划分，不同的区域，不同的风险等级不同的监测重点，对生产区域，配套区域，必需的流通环节，同时对外部环境，充分了解评估，通过内部环境评估和外源环境监控建立自己的监控体系，经过前期病原监测、信息搜集、场地条件等评估猪场现在的暴露风险等级，基于暴露风险等级，制定不同的生物安全及管理策略，备齐物资，设定有目标、可执行的预案，并对员工培训、设施改进、流程优化等方式，严格执行预设方案, 设立合理的执行情况检查制度，根据现场执行情况，周边疫情发展，病原监测结果等汇总反馈，动态了解自身现状，不断提升自己，才是安全的保障。
2、已发生问题猪场的精准清除
感染猪的精准清除基本原则：
早发现（最好在潜伏期第1-3天）
早处置（按照“连坐方式”）
采样方式、检测试剂正确选择
避免交叉污染
成功来源于：
鼻腔拭子是理想的样本
清理阳性猪及病死猪
提早预案、编组连坐、猪不落地、封闭猪栏、因地制宜，有效隔断
全栋过筛-全场排查-淘汰阳性猪只（即编组连坐式）
排查染疫原因 避免再次发生（同时进行）
建立全场ASF监控体系（后续进行 关键风险点的监控）
评估风险和解除ASF应急状态（猪群在28天后没有发现新增病例即可解除应急状态）
3、关于复养的思考
复养是很多猪场都在面临的现实问题，但复养是一个系统工程，需要全盘考虑，从外部环境评估，生物安全设施改进，场内改造，饲养模式的选择，洗消及风险评估，哨兵猪的引入、后备猪入场等，都需要系统性的考虑。
总结
非洲非洲猪瘟的现在防控重点是依然是生物安全：不动猪，守住人，卡住车，严控物，净水源，蚊虫鼠蝇一起防
猪场的监控重点是建立健全完善的猪群的监控体系，发挥风险预估与预警机制
精准监测，快速响应，早、快、准、狠，是精准清除的要素
复养要有大局观，整体管控，防非瘟的同时要兼顾生产
致谢：感谢第一届兽医检测诊断大会上所有嘉宾的精彩报告。
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